01

文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

氣單胞菌屬是人類、動(dòng)物和水生生物極其重要的傳染性病原體。該病原菌廣泛存在于水生環(huán)境中，多數(shù)菌株具有較高的致病性，可引起水生動(dòng)物疾病、導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)巨大的損失。此外，氣單胞菌還會(huì)引起人類腹瀉，且目前病例也日漸增加，對(duì)公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生了嚴(yán)重的問(wèn)題。疫苗接種被認(rèn)為是預(yù)防感染的有效策略。

氣單胞菌的毒力因子，主要包括脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMPs）、氣溶酶（Aer）、鞭毛蛋白（Fla）等。其中，鞭毛蛋白（fla）是細(xì)菌鞭毛的主要成分，主要包括flaA和flaB，具有良好的免疫原性，可作為血清學(xué)鑒定的基礎(chǔ)。鞭毛蛋白（FlaB）是氣單胞菌的多種毒力因子之一，可以作為一種良好的免疫抗原，可單獨(dú)免疫宿主，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的發(fā)展前景。

黏膜是外來(lái)病原體與魚(yú)類接觸時(shí)遇到的第一道屏障，而魚(yú)會(huì)通過(guò)局部免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。與傳統(tǒng)免疫相比，黏膜免疫會(huì)產(chǎn)生高水平的抗體，強(qiáng)烈激活宿主T細(xì)胞和應(yīng)激反應(yīng)。特別是粘膜免疫非常適合于動(dòng)物間大規(guī)模傳染病的預(yù)防。因此，基于黏膜免疫制備的口服疫苗是治療魚(yú)類氣單胞菌感染等水生疾病的合適方法。采用黏膜免疫法制備的魚(yú)類口服疫苗比傳統(tǒng)的注射疫苗更具優(yōu)勢(shì)。

乳酸菌作為黏膜免疫的良好蛋白傳遞載體，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答和免疫耐受，被廣泛認(rèn)為是能夠抵抗腸道不良環(huán)境并完成定植和抗原呈現(xiàn)的疫苗載體。吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院和河北科技師范大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的Yi－Di Kong，Yuan－Huan Kang等人2019年在《Fish and Shellfish Immunology》雜志上（IF 2018＝3．185，農(nóng)林科學(xué)1區(qū)）發(fā)表了題為“Oral immunization with recombinant Lactobacillus casei expressing flab confers protection against Aeromonas veronii challenge in common carp，Cyprinus carpio”的文章。在本文中，作者研究開(kāi)發(fā)了兩種木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)氣單胞菌flaB的干酪乳桿菌菌株，并以免疫原性作為疫苗載體誘導(dǎo)魚(yú)對(duì)氣單胞菌的免疫應(yīng)答。

02

所用到的主要方法

METHODS

1．質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)

2．Western blot

3．免疫熒光分析

4．ELISA

5．白細(xì)胞吞噬作用分析

6．qRT－PCR

03

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

用SmaI／EcoRV或BamHI／XhoI限制性內(nèi)切核酸酶消化flaB基因（900 bp）的純化PCR產(chǎn)物，分別插入pPG－1或pPG－2表達(dá)載體的相應(yīng)位點(diǎn)，得到pPG－1－flaB或pPG－2－flaB。重組的pPG－1－ flab和pPG－2－ flab經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化入干酪乳桿菌（Lactobacillus casei ）CC16，同時(shí)采用不含flaB基因（Lc－pPG）的pPG質(zhì)粒的干酪乳桿菌作為載體對(duì)照。實(shí)驗(yàn)首先采用Western blot分析及免疫熒光對(duì)重組flaB基因在干酪乳桿菌菌株中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析檢測(cè)。此外，利用PCR和測(cè)序技術(shù)篩選重組干酪乳桿菌，并分析了細(xì)胞的生長(zhǎng)和遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒可以穩(wěn)定遺傳超過(guò)50代，外源抗原的表達(dá)和分泌對(duì)宿主菌細(xì)胞生長(zhǎng)基本上沒(méi)有太大的影響。在口服重組干酪乳桿菌Lc－pPG－1－flaB和Lc－pPG－2－flaB免疫鯉魚(yú)后，魚(yú)體內(nèi)ACP、AKP、LZM、SOD活性增加，血清免疫指標(biāo)增強(qiáng)，免疫組織中IL– 10、IL－β、IFN－γ和TNF－α的表達(dá)增加。在腸道中能夠檢測(cè)到重組干酪乳桿菌的存活，并且，在用病原菌維隆氣單胞菌（Aeromonas veronii）攻擊宿主時(shí)，給予Lc－pPG－1－flaB（66．7％）和Lc－pPG－2－flaB（53．3％）免疫組的存活率均明顯高于對(duì)照組。

這些結(jié)果表明：flaB重組干酪乳桿菌可以定植到鯉魚(yú)的腸道，并促進(jìn)免疫應(yīng)答、增強(qiáng)鯉魚(yú)對(duì)氣單胞菌感染的抗病性，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。

干酪乳桿菌合成的新型納米硒可抑制大腸桿菌對(duì)腸屏障功能的破壞