大家好,今天和大家分享的是12分學(xué)習(xí)筆記。

題目:激活WNT可作為髓母細(xì)胞瘤的治療策略

一、研究背景

MB是最常見(jiàn)的兒童惡性腦腫瘤, 分為四個(gè)分子亞組(Wnt,Shh,第3組,第4組)。

在臨床上,Wnt MBs的預(yù)后較好,而非Wnt MB易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差。

已有報(bào)道證明Wnt激活在Shh驅(qū)動(dòng)的MB中存在抗腫瘤作用。

二、研究流程

1、檢測(cè)MB中不同亞型之間的差異

2、探究Wnt與自我更新能力的關(guān)系

3、探究Wnt活性與致瘤潛力的關(guān)系

4、探討wnt通路的激活對(duì)腫瘤的影響

三、結(jié)果分析

1、MB BTIC保留小組隸屬關(guān)系

   作者對(duì)大規(guī)模的MB數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析,并使用單樣本基因富集分析(ssGSEA)對(duì)上調(diào)的基因進(jìn)行評(píng)分,發(fā)現(xiàn)其分別在Wnt,第3組和第4組MB樣品中顯示出最強(qiáng)的正富集(補(bǔ)充圖 1b)。因此,MB BTIC系之間存在子組隸屬關(guān)系。

   通過(guò)對(duì)非Wnt MB(第3組和第4組)的基因集富集分析(GSEA)與主成分分析(PCA),作者發(fā)現(xiàn),Bmi1基因表達(dá)活躍。而在Wnt MB系中,細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和凋亡基因標(biāo)記更為活躍。

   使用體外和體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn),通過(guò)TCF報(bào)告基因檢測(cè),作者發(fā)現(xiàn),與第3組和第4 組MB系相比,Wnt中內(nèi)源性Wnt活性顯著增加。

2、MB BTICs中的異位Wnt激活損害腫瘤發(fā)生

   作者在Wnt3A條件培養(yǎng)基培養(yǎng)SU_MB002細(xì)胞,評(píng)估第3組MBS中 Wnt/β-catenin通路的完整性,發(fā)現(xiàn)Axin2基因(Wnt下游靶基因)表達(dá)顯著增加,繼發(fā)性腫瘤球的體積減小、發(fā)生頻率降低,即Wnt激活后侵襲性MB的致癌表型發(fā)生改變。

   Bmi1和Sox2基因?qū)��?xì)胞自我更新能力至關(guān)重要,與患者存活顯著關(guān)聯(lián)。對(duì)基因表達(dá)量高低、年齡,轉(zhuǎn)移狀態(tài)和亞組與Bmi1和Sox2基因進(jìn)行單因素和多因素生存分析(圖1a),發(fā)現(xiàn)Sox2基因表達(dá)量高低與患者生存率顯著相關(guān)。在Western plot 中,與Shh(Daoy),第3組(SU_MB002,HD-MB03,RCMB40,D425,Med8A,D458)和第4組(ICB1299)相比,Wnt MB BTIC(BT853)中自我更新基因Bmi1和Sox2的表達(dá)均降低(圖 1b),表明跨MB亞組的自我更新活動(dòng)存在差異。

   編碼β-catenin的CTNNB1在86%的Wnt MB中發(fā)生了突變,AXIN2是重要的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控因子,于是用Axin2的表達(dá)來(lái)確定第3組中β-catenin突變體的過(guò)表達(dá),隨之發(fā)現(xiàn)Bmi1和Sox2表達(dá)量減少(圖1c、d),而且與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)β-catenin的細(xì)胞系的自我更新能力也顯著降低(圖1e)。

   因此,說(shuō)明抑制自我更新途徑可以解釋W(xué)nt MB的轉(zhuǎn)歸改善。

圖1:MB BTICs中的異位Wnt激活損害腫瘤發(fā)生

3、非Wnt MB含有致瘤性較低的Wnt活性細(xì)胞

   作者通過(guò)檢測(cè)不同亞組的GSVA富集得分(圖2a),對(duì)Group 3和Group 4 MB中Wnt亞組中的Wnt活性進(jìn)行判斷。作者讓細(xì)胞分類(lèi)著色以此來(lái)豐富Wnt亞組的標(biāo)記(圖2b),暗紅色細(xì)胞表示超過(guò)了5%的臨界值,并被認(rèn)為顯著富集了基因標(biāo)記,而灰細(xì)胞則表示未通過(guò)閾值。接著,作者進(jìn)一步采用箱型圖表示每個(gè)樣本中的Wnt亞組標(biāo)記的得分(圖2c),以及在疊加條形圖中用暗紅色區(qū)域來(lái)表示說(shuō)明每個(gè)樣品中富含Wnt亞組基因特征的細(xì)胞比例(圖2d)。

   因此,作者說(shuō)明非Wnt MB中也含有致瘤性較低的Wnt活性細(xì)胞,并在scRNA-SEQ的四個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集和大塊腫瘤RNA-SEQ數(shù)據(jù)得到驗(yàn)證。

圖2:非Wnt MB含有致瘤性較低的Wnt活性細(xì)胞

   接下來(lái),作者想要探究Wnt活性與Wnt MB中致瘤潛力的關(guān)系。于是使用慢病毒W(wǎng)nt報(bào)告基因(7XTCF-GFP),從第3組MB細(xì)胞中鑒定出Wnt活性細(xì)胞(TGP +),并用流式細(xì)胞儀分離出Wnt活性(TGP +)和Wnt惰性(TGP-)細(xì)胞。然后,作者使用基于TCF的熒光素酶報(bào)告基因分析法驗(yàn)證了TGP +細(xì)胞中的Wnt活性(圖 3a)和Axin2轉(zhuǎn)錄水平(圖 3b),發(fā)現(xiàn)與TGP-細(xì)胞相比,TGP +細(xì)胞中Bmi1和Sox2的表達(dá)水平更低。

   對(duì)小鼠顱內(nèi)注射稀釋后的SU_MB002 TGP +與TGP-細(xì)胞。與注射TGP-相比,TGP +異種移植物減少了腫瘤負(fù)荷(圖3e)并提高了存活率(圖3f)。通過(guò)對(duì)這些異種移植物中的GFP(異種移植物免疫組化染色的一抗)陽(yáng)性進(jìn)行免疫染色,觀察到部分TGP +細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)GP-細(xì)胞(圖3g)。

   Wnt標(biāo)記高表達(dá)的難治性MB患者(Wnt high)與Wnt標(biāo)記低表達(dá)(Wnt low)的患者相比,總體生存率有所改善 (圖3h), 這似乎預(yù)示著Wnt標(biāo)記高表達(dá)MBs存活率會(huì)提高。

   因此說(shuō)明,隨著難治性MBs的內(nèi)源性Wnt活性提高,MB細(xì)胞的致瘤特性會(huì)降低。

圖3:探究Wnt活性與Wnt MB中致瘤潛力的關(guān)系

4、MB異種移植物的藥理學(xué)Wnt活化可提高生存率

   GSK-3通過(guò)磷酸化下游Wnt效應(yīng)子β-catenin,使其失去功能,從而抑制Wnt /β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。小分子CHIR99021為GSK-3的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ATP;而L807mts是GSK-3的底物競(jìng)爭(zhēng)性肽抑制劑。

   細(xì)胞經(jīng)L807mts處理后,TCF報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)與GSEA富集分析檢測(cè)到Wnt激活,PCA分析檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄機(jī)制發(fā)生變化(圖 4a),且RNA-seq數(shù)據(jù)也顯示出不同的基因表達(dá)譜(圖 4b);另外,GSEA發(fā)現(xiàn)L807mts處理的樣品中凋亡和G2M檢查點(diǎn)相關(guān)基因標(biāo)記的表達(dá)增加(圖4c),而且,在體外(圖4d)和體內(nèi)(補(bǔ)充圖24)用L807mts治療后觀察到放射增敏作用的增加,同時(shí),Bmi1和Sox2水平也降低了(圖4e、4f)。

圖4:MB異種移植物的藥理學(xué)Wnt活化

   給植入SU_MB002細(xì)胞或RCMB40細(xì)胞的小鼠,每隔一天以50μg/劑量進(jìn)行L807mts治療,發(fā)現(xiàn),總體腫瘤負(fù)荷減少(圖 5a–c,補(bǔ)充圖 25a-b)和總體生存率提高(圖 5d,5e)。這些臨床研究說(shuō)明了高度特異性小分子Wnt激動(dòng)劑具有治療MB的潛在臨床效用。

圖5:L807mts治療后,總體腫瘤負(fù)荷與總體生存率的變化

小結(jié)

MB分為四個(gè)亞組,在臨床上,Wnt MBs的預(yù)后較好,而非Wnt MB易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差。本文通過(guò)檢測(cè)不同亞組的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)Wnt活性高低存在差異,而B(niǎo)mi1和Sox2基因的表達(dá)可反映腫瘤的自我更新能力。作者增加wnt表達(dá), 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自我更新能力下降,腫瘤進(jìn)展放緩;接著進(jìn)一步從體內(nèi)驗(yàn)證Wnt活性降低了致瘤潛力。最后,在機(jī)制上通過(guò)L807mts抑制GSK-3,進(jìn)一步驗(yàn)證了激活Wnt /β-catenin途徑可抑制腫瘤進(jìn)展,說(shuō)明激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)可作為潛在靶向第3組和第4組MB的治療策略