前言

GLP-1R因其優(yōu)異的降糖、減重功效而爆火，代表性藥物司美格魯肽還通過不斷拓展心血管、NASH新適應癥持續(xù)出圈，預計2024年將榮登藥王寶座。GLP-1成為近年來最火熱的研發(fā)藥物之一。然而，GLP-1作為人體內源肽，其本身半衰期短的問題也成為了各家研發(fā)企業(yè)首要解決的問題。

從氨基酸替換、脂肪鏈的引入、融合蛋白策略，再到抗體偶聯和藥物緩控釋技術，GLP-1長效策略歷經更迭，并正突破周制劑的限制，向更長效制劑發(fā)展。

長效GLP-1制劑開發(fā)難點

GLP-1（胰高血糖素樣肽-1）是一種由腸道內分泌L細胞和腦干孤束核內的某些神經元在進食后產生和分泌的活性肽類激素。在人體內，其通過結合GLP-1受體（GLP-1R），激活受體的信號傳導，從而發(fā)揮了抑制胰高血糖素分泌、增加胰島素分泌、減緩胃腸道蠕動、抑制食欲等的生物學功能，從而可以參與人體內血糖平衡調節(jié)。此外，GLP-1還有延緩胃排空、抑制食欲、心血管保護的功能。

圖1. GLP-1的作用機制

盡管GLP-1有諸多優(yōu)點，但臨床開發(fā)最致命弱點是GLP-1在血液中的半衰期較短，主要原因有兩個：一是因為被受體內二肽基肽酶4 (DPP-4) 以及中性肽鏈內切酶(NEP)所降解，兩者的切割會使GLP-1失活。二是GLP-1在體內會被腎臟清除而快速降解，這使得內生GLP-1在體內的半衰期約為 2 min，且只有 10-15% 的GLP-1 完整地進入循環(huán)，空腹血漿水平僅為 0-15 pmol/L。

圖2. GLP-1酶切位點

解決方法無非是“開源節(jié)流”，最早期采用的是“節(jié)流”的方式，科學家設計了小分子二肽基肽酶抑制劑，并最終成功用于臨床，從而降低GLP-1在體內的降解，從而達到降糖作用，但療效和時效并不好。“開源”是指通過優(yōu)化GLP-1結構及載體技術提高體內GLP-1（類似物）的濃度和作用時間，以獲得更好的治療效果，提升患者的依從性。

短效GLP-1受體激動劑通過氨基酸取代等方式減少其被蛋白水解降解，如每日兩次的艾塞那肽，但這類藥物在腎臟中被快速清除，仍難以延長循環(huán)時間；因此，一系列修飾遞送的策略如白蛋白融合、Fc蛋白融合、脂肪酸�；�等應用，開發(fā)出了利西拉肽、利拉魯肽等日制劑和度拉糖肽、司美格魯肽、替爾泊肽等周制劑。

雖然已上市產品將治療頻率從每日減少到每周，但從文獻報道來看，與每日一次給藥頻率相比，每周一次給藥頻率并不能顯著提高患者的依從性，仍存在改進的空間。臨床數據表明，T2D 患者一年內對注射司美格魯肽的依從性在 39% 至 67% 之間，使用該藥物減肥的患者依從性并不算高。

圖3. GLP-1酶切位點

第一代長效策略

第一代的長效策略是氨基酸序列的改造和修飾，艾塞那肽和利西拉肽是第一代長效策略的產物。該長效策略的靈感來自從吉拉毒蜥（Heloderma suspectum）的唾液中發(fā)現的Exendin-4，其結構與人類GLP-1僅有53%的同源性，但其和人GLP受體的結合能力要比GLP-1強，這歸因于兩者N端關鍵氨基酸的高度相同。

與GLP-1相比，Exendin-4的第二位置的Gly取代了Ala，因此對DPP-4的消化作用更加耐受，使得 Exendin-4能夠有30min的半衰期，皮下注射能夠保持2.4h的有效濃度�；�于Exendin-4的特性，通過對其序列的改造和修飾，得到了兩款藥物艾塞那肽和利西拉肽兩款藥物。其中，艾塞那肽每日注射兩次，利西拉肽每日注射一次。

圖4. 利西拉肽與Exendin-4序列比對

第二代長效策略

第二代長效策略包括了引入脂肪酸鏈、脂融合白蛋白、融合Fc蛋白等分子設計策略，也包括藥物緩釋系統(tǒng)這一制劑開發(fā)策略，正是這些策略的使用讓GLP-1周制劑被成功研發(fā)。

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脂肪酸鏈的引入

除了抑制DPP-4，Novo Nordisk的科學家們從另一個角度切入，看到了與白蛋白結合對GLP-1類藥物的巨大優(yōu)勢，能夠有效延長其半衰期。白蛋白（Albumin）是血漿中含量最高的一種蛋白質，可以跟脂肪酸結合，并有重要的生理意義，至今為止，人們已經發(fā)現白蛋白上與脂肪酸結合的11個位點�；�于此，Novo Nordisk的科學家們開始專注于在GLP-1上引入脂肪酸鏈。

引入脂肪酸鏈延長GLP-1半衰期的機制主要有：脂肪酸與質膜和注射部位的白蛋白結合形成復合物，由于尺寸較大，同時脂質化修飾導致多肽藥物分子疏水性增加，導致注射后組織中和毛細血管壁上的擴散速率降低；除此之外，進入系統(tǒng)循環(huán)的脂化多肽，由于與白蛋白之間的可逆、高親和結合，提高了多肽藥物的藥代動力學特征，降低腎臟清除率并利用FcRn介導的循環(huán)利用來增加半衰期。

圖5. 引入脂肪酸鏈后與白蛋白的作用機制

總的來說，脂質化的潛在優(yōu)勢主要歸因于幾個關鍵作用：提升半衰期、增強遞送、提高藥理效力和降低免疫原性。

圖6. 引入脂肪酸鏈后GLP-1與白蛋白的作用機制

脂肪酸鏈的引入效果受到脂質類型、長度和引入位點的影響。脂質類型方面，與引入一元脂肪酸相比，脂肪二酸類型的引入利于提供更強的白蛋白親和力，由于引入了額外的羧酸基團，因此可能導致更長的半衰期。引入長度方面，在一定范圍內，其與白蛋白結合的親和力隨烷基鏈的長度而增加。1,18-十八烷二酸（C18二酸）和 1,20-二十烷二酸（C20二酸）是迄今為止測試過的對白蛋白具有最高親和力的脂肪酸，因此具有更長的半衰期。引入位點方面，合適的位點決定了藥物的最佳效力和半衰期，尤其是當脂肪酸直接修飾到主鏈。

圖7. C18二酸和C20二酸化學結構

利拉魯肽、司美格魯肽是引入脂肪酸以延長半衰期的經典代表。

圖8. 利拉魯肽與司美格魯肽結構

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PEG修飾

聚乙二醇(PEG)是由經環(huán)氧乙烷聚合而成，其相對分子量(Mr)主要在200-40000的乙二醇高聚物。聚乙二醇中性、無毒、具有獨特的理化性質和良好的生物兼容性，并且是少數被FDA批準可用于體內注射用藥的化學物質。

長效化是PEG修飾藥物對藥效的主要改良方向之一。但其應用遠不局限于“長效化”，還能改變化合物的理化性質使前藥在到達特異性作用靶點后被活化而發(fā)揮藥效，或改變小分子的脂溶性或水溶性以降低毒副作用等等。

目前全球已有二十余款PEG修飾藥物獲批上市，市場規(guī)模超百億元。其中PEG重組人生長激素和PEG干擾素、培非格司亭等PEG修飾大分子藥物已在國內廣泛應用。

將PEG修飾的位點轉移至C端(羧基)則是一種有效的修飾策略。PEG洛塞那肽就是一個應用的例子。

2019年5月，NPA通過優(yōu)先審評審批程序批準豪森藥業(yè)的 1 類創(chuàng)新藥PEG洛塞那肽注射液。該藥物是全球第一款PEG化的長效降糖藥物，每周僅需注射一次。獨特的PEG修飾技術賦予洛塞那肽多項優(yōu)勢，使其半衰期延長，在顯著降低血糖的同時，血糖波動小，起效快，且不良反應發(fā)生率降低。

Diapin Therapeutics由雙鷺藥業(yè)與美國密歇根大學合作合資設立，最初主要從事開發(fā)糖尿病預防/治療藥物，后又增加心腦血管治療領域的藥物開發(fā)。目前，雙鷺藥業(yè)持有Diapin Therapeutics 30%的股權。

圖9. 聚乙二醇洛塞那肽

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融合白蛋白

通過融合白蛋白增加藥物半衰期是多肽藥物設計的常見技術。對于重組蛋白和多肽藥物等，可以通過人血清白蛋白（HAS）修飾提高藥物半衰期，減少給藥頻率，提高患者順應性。

圖10. 血清白蛋白（HSA）的應用

白蛋白顯著增強GLP-1藥物在體內半衰期主要通過兩個方式：一方面GLP-1與白蛋白融合后，分子量增大，因此無法穿過腎小球上皮細胞間隙，逃脫了被腎臟清除，繼續(xù)回到血液循環(huán)中發(fā)揮藥效作用；另一方面，白蛋白還可以和內皮細胞的FcRn結合，通過FcRn內化循環(huán)，逃逸溶酶體的降解，再進入循環(huán)系統(tǒng)。

圖11. 白蛋白延長半衰期機制

早期的HSA修飾是將多肽直接與HSA進行融合，沒有引入連接肽。比如GSK開發(fā)的Albiglutide于2014-4-15獲FDA批準上市，用于Ⅱ型糖尿病的治療，是第一個獲批的HSA融合的長效藥物。Albiglutide將GLP-1的8位氨基酸突變?yōu)镚LY后進行串聯，然后直接融合到HSA的N端，其半衰期可延長至5天，每周給藥一次即可。然而，2017年，GSK宣布該藥物從全球市場撤出。

圖12. Albiglutide結構

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融合Fc蛋白

Fc融合蛋白是一種結合肽或蛋白的試劑，是一種基于IgG的嵌合融合蛋白，其不僅保留了功能蛋白分子的生物學活性，還具有一些抗體的性質，如通過結合相關 Fc 受體延長半衰期。

圖13. Fc融合蛋白結構

Fc融合蛋白含有的抗體Fc段，雖不能進行抗原-抗體反應，但Fc段可介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）、補體依賴的細胞毒性（complement dependent cytotoxicity, CDC）作用等各種生物學功能，并且可以根據4種亞型介導的細胞毒差異選擇融合伴侶。依靠融合伴侶的長效機制，可通過新生兒Fc受體（neonatal Fc receptor, FcRn）介導的循環(huán)途徑延長藥物在血漿內的半衰期、增加融合蛋白的穩(wěn)定性等。

利用Fc延長半衰期最成功的案例是禮來的明星藥物度拉糖肽，其應用了多個長效策略：首先應用了氨基酸替換策略，將8位的丙氨酸（Ala）替換為甘氨酸（Gly8）以抵抗DPP-4降解，22位的甘氨酸（Gly）替換為谷氨酸（Glu22）從而穩(wěn)定了分子的二級結構并提高了效力，將36位的精氨酸（Arg）替換為甘氨酸（Gly36），以避免潛在的T細胞表位；其次，選擇了IgG4的Fc區(qū)域來起到延長半衰期的作用，同時為了減少其與FcR的相互作用，對其中幾個序列做了修改，避免ADCC免疫副作用。最后，在GLP-1類似物和Fc部分之間使用一個包含16個氨基酸的超長連接子，避免了因為和Fc融合而帶來的藥物失活。

圖14. 度拉糖肽結構

5

藥物緩釋系統(tǒng)

利用藥物遞送系統(tǒng)提高GLP-1藥物半衰期的嘗試包括：聚合物水凝膠、納米顆粒和微球等。然而，到目前為止，只有基于聚乳酸-羥基乳酸共聚物（PLGA）的GLP-1藥物獲得了FDA的批準。

（1）微球制劑

緩釋微球制劑可使包裹于其中的多肽類藥物緩慢釋放，在體內達到緩釋長效的作用。以可生物降解聚合物如PLGA 為骨架材料，包裹蛋白多肽類藥物制成注射微球，通過肌肉或皮下注射給藥，隨著聚合物的降解，藥物以擴散、溶蝕 方式釋放，可緩慢釋放 1 周，或長達數月，可大大減少給藥次數，顯著提高患者用藥的順應性。

圖15. PLGA結構式

微球制劑已廣泛引應用于多肽領域，代表性藥物有亮丙瑞林微球、曲普瑞林微球、奧曲肽微球和帕瑞肽微球等�？梢酝ㄟ^人為控制聚合制備工藝，改變黏度及分子量等參數，進而靈活地控制載藥微球的降解速度，以調節(jié)所包埋多肽藥物的釋放速率。

注射用艾塞那肽微球，是FDA批準的基于PLGA的艾塞那肽聚合物微球制劑。雖然PLGA的降解時間長達六個月以上，但艾塞那肽-PLGA微球制劑僅僅能實現每周一次的給藥頻率。

圖16. Glutazumab結構

艾塞那肽微球制劑雖然可以實現每周一次給藥，但有一個缺點是無法在體內以穩(wěn)定的速率釋放GLP-1 藥物。

圖17. 注射用艾塞那肽微球藥物釋放曲線

微球制劑是實現每月一次給藥的有效途徑。但大多數早期開發(fā)的PLGA注射劑都具有突釋特征，導致注射后幾天體內的藥物濃度很高，PLGA微球在體內的突釋會導致嚴重的不良反應。

（2）水凝膠長效制劑

微球制劑雖然增加了多肽藥物的效用，但微球仍需要被優(yōu)化，以實現適當的藥庫相容性和釋放行為，并且只有相對疏水性的多肽才能顯示出長達數月的釋放。因此，科學家們開始轉向利用水凝膠技術，以開發(fā)出一年3-4次注射的超長效GLP-1制劑。

基于水凝膠的制劑（Hydrogel-based formulations）是親水性聚合物在水性介質中形成交聯網格的制劑。水凝膠中含水量很高，可以用于親水性小分子、大分子藥物和細胞的遞送。為獲得長效水凝膠制劑，藥物分子必須要先包載到聚合物的網格中，通過高密度交聯來降低聚合物鏈之間的間距，這可以減緩藥物從凝膠基質中的擴散速率。水凝膠制劑釋放藥物的機制主要依靠聚合物的降解和侵蝕作用，可以持續(xù)釋放藥物數周至數月。

近期，由斯坦福大學工程學院科學家、Novo Nordisk研究人員組成的聯合團隊開發(fā)出了一種新型水凝膠藥物遞送系統(tǒng)（水凝膠儲庫技術），可以將 GLP-1 的給藥頻率減少到 4 個月一次。根據他們的計算模型，該遞送系統(tǒng)在大鼠體內分泌治療濃度的利拉魯肽 42 天，相當于在人類體內分泌 4 個月。

研究團隊開發(fā)出了一款聚合物納米顆粒（PNP）水凝膠，將疏水修飾的 HPMC 與 PEG-PLA 納米顆粒混合制備的 PNP 水凝膠能夠以 100%的效率輕松封裝GLP -1 受體激動劑。這種水凝膠由聚合物鏈和納米顆粒組成的網狀物形成的，它們彼此之間的結合較弱，雖然可以像水凝膠一樣結合，但隨著時間的推移會緩慢消散，網狀物包載藥物分子，網狀物溶解進而釋放藥物。

圖18. 水凝膠制劑結構

由于這種聚合物納米顆粒水凝膠具有一定的流動性，可以使用常規(guī)注射器注射，其注射后會在皮膚下形成一個微型“藥物倉庫”，注射后能夠在體內停留長達 4 個月，持續(xù)釋放 GLP-1 受體激動劑發(fā)揮功效。

在動物模型試驗中，研究人員將其注射到 T2D 模型大鼠中，在為期 6 周的監(jiān)測時間內，這兩種藥物都保持在治療濃度，并與標準注射藥物一樣降低了動物的血糖水平。

圖19. 基于新型水凝膠的 GLP-1 藥物在人體內的藥代動力學建模

每 4 個月一次的治療可能是臨床糖尿病管理的理想選擇，因為這將與患者復診的典型節(jié)奏保持一致，而這種水凝膠系統(tǒng)的釋放時間可以從一天到六個多月不等，該項技術有望使GLP-1藥物注射頻率減少至1年3次。圍繞此次 GLP-1 受體激動劑的研究，如果接下來的實驗，研究人員預計將在一年半到兩年內開展人體臨床試驗。

第三代長效策略

如果說第二代長效策略使每日制劑進化成為每周制劑，那第三代長效策略則有可能使每周注射的GLP-1制劑向每月一次甚至幾個月一次的制劑邁進。

1

抗體偶聯策略

融合蛋白仍非長效機制的最優(yōu)解，串聯肽-抗體融合物容易受到蛋白水解作用，Regeneron給出抗體偶聯GLP-1類似物的新策略。

2022-3-17，Regeneron的GLP-1R靶向ADC新藥的專利WO2022056494公開。專利中，Regeneron將特異性靶向GLP-1R胞外結構域的抗體或與功能性激活GLP-1R的GLP-1肽模擬物相偶聯，組合成的抗體-藥物綴合物。Regeneron給這項技術起了個新的名詞：antibody-tethered drug conjugates (ATDCs)，抗體束縛藥物綴合物。

值得注意的是，Regeneron的這款GLP-1R靶向ADC與傳統(tǒng)的ADC有所不同，抗體結合GLP-1R的胞外區(qū)，而payload結合的是GLP-1R的跨膜區(qū)。這一機制的優(yōu)勢是：促進了親和力、提升藥效的同時，提升了GLP-1多肽的穩(wěn)定性與半衰期，降低清除率，達到長效穩(wěn)定的GLP-1激動效果。

圖20. Fc融合蛋白結構

相比于GLP-1，這種GLP-1R ATDC具有更強的激動劑活性。在臨床前試驗中，Regeneron選擇了高脂飲食肥胖小鼠模型。度拉糖肽作為陽性對照，給藥頻次為每周兩次，持續(xù)4周。而三個ATDC化合物均為只在第0天，單次給藥。實驗持續(xù)8周，每組給藥均為25 mpk。

實驗結果顯示出了這款新藥對體重長效控制效果：度拉糖肽組小鼠僅在第3天與第7天觀察到了減重效果，之后便體重反彈。而三個ATDC實驗組小鼠，盡管只接受了單次給藥，減重效果分別維持了4周、6周與8周。這一臨床前結果頁體現出ATDC藥物相較于GLP-1多肽的優(yōu)勢，初步具備成為月制劑的潛力。

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抗體融合策略

將 GLP-1 融合到一個大的“載體”部分是延長半衰期和給藥間隔的有效方法。

2018年，Gmax （鴻運華寧生物）團隊在《Biochemical Pharmacology》雜志刊文，報道了Glutazumab 抗體通過雙結合位點作用機制在抗糖尿病治療效果。

研究團隊將23個氨基酸的肽連接物GLP-1（7-35）片段與人源化GLP-1R抗體（IgG2）的輕鏈融合。Glutazumab具有天然GLP-1的藥理作用和高特異性抗體的結構屬性。研究團隊通過實驗證實了Glutazumab中的 Ab1 和 GLP-1 片段都有助于 GLP-1R的結合和激活，同時GLP-1R抗體片段 Ab1 可能通過受體靶向減少脫靶效應。

圖21. Glutazumab結構

Glutazumab具有與度拉糖肽類似的激動劑性能，并強于野生型GLP-1多肽，由于抗體識別的因素，Glutazumab誘導的胰島素分泌能力強于度拉糖肽。

鴻運華寧給出的長效策略是串聯GLP-1多肽與GLP-1R單抗的融合蛋白，Glutazumab表現出了優(yōu)于同類GLP-1類似物的安全性、耐受性，以及降糖減重效果，有望成為新一代超長效降糖（2周甚至每月一次）和減重（1周甚至每月一次）治療藥物。

結語

GLP-1藥物長效策略經過了三代的發(fā)展，每一代藥物都是基于上一代藥物的長效策略進行優(yōu)化迭代，凝結了幾代科學家的研發(fā)智慧。

從氨基酸序列的修飾替換、到引入脂肪酸鏈，再到微球、水凝膠等長效策略，GLP-1藥物已升級到了每周一次制劑；但每周一次給藥仍不能很好地提高患者依從性，抗體偶聯、抗體融合等策略應運而生，在不久的未來有望誕生一年僅需注射數次的降糖、減肥制劑，這將是GLP-1領域的巨大突破。

圖22. GLP-1藥效發(fā)展進程

| 引用資料

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[12] 醫(yī)藥魔方：萬物皆可偶聯：再生元的減肥藥GLP-1 ADC

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       原文標題 : GLP-1藥物長效策略集錦