前言

Toll樣受體（TLRs）是一種先天免疫受體，直接或間接負責(zé)檢測病原體相關(guān)分子模式（PAMP），并通過激活先天和適應(yīng)性免疫途徑對其作出反應(yīng)。TLRs是抵御微生物病原體的第一道防線，TLR可以分為細胞表面和內(nèi)體亞家族，識別不同的PAMP，并激活常見和特定的信號通路以形成免疫反應(yīng)。盡管具有保護功能，TLR的異常反應(yīng)仍會導(dǎo)致炎癥和自身免疫性疾病。了解TLR激活和調(diào)節(jié)機制之間的微妙平衡對于破譯它們在免疫防御和疾病發(fā)病機制中的雙重作用至關(guān)重要。

此外，天然存在和合成的TLR激動劑可以利用這些內(nèi)源性免疫信號通路來增強和調(diào)節(jié)疫苗反應(yīng)，從而使其成為優(yōu)良的疫苗佐劑。這不僅對開發(fā)針對傳染病的疫苗具有重要意義，而且對針對癌癥、過敏、阿爾茨海默病和其他疾病的免疫療法也具有重要意義。

TLR的發(fā)現(xiàn)史

1989年，Charles A. Janeway提出了一個突破性的假設(shè)，表示先天免疫系統(tǒng)具有通過主要在哨兵細胞上表達的受體檢測微生物感染的顯著能力，稱之為“模式識別受體（PRRs）”。這些受體識別稱為“病原體相關(guān)分子模式”的不同分子結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在病原體中廣泛表達，對其生存至關(guān)重要，但在宿主細胞中明顯缺失。這使得PRRs能夠有效地區(qū)分自我和非自我，并啟動先天免疫反應(yīng)。

1996年，Hoffmann等人進行的一項研究證實了Janeway的假設(shè)。該研究表明，果蠅攜帶一種名為“Toll”的受體突變，由于抗真菌肽的誘導(dǎo)缺陷，對真菌感染表現(xiàn)出更高的易感性。隨后，Janeway和Medzhitov的進一步探索鑒定出了Toll的人類同源物，最初稱為hToll，后來被確認為Toll樣受體4（TLR4）。TLR4的發(fā)現(xiàn)揭示了它通過激活轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（NF-κB）誘導(dǎo)先天反應(yīng)的能力，包括產(chǎn)生促炎細胞因子和表達共刺激分子。

隨后，在人類和小鼠中分別鑒定出10個和12個TLR，每個TLR都能識別多種PAMP。TLR1至TLR9在兩個物種中都是保守的；由于逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的DNA插入，小鼠TLR10不起作用；TLR11、TLR12和TLR13不存在于人類基因組中。TLRs的發(fā)現(xiàn)推翻了人們最早的認識，即先天免疫系統(tǒng)識別病原體是非特異性的。

TLR的結(jié)構(gòu)和信號通路

TLR屬于I型跨膜蛋白，包括負責(zé)PAMP識別的富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）的外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和激活下游信號通路的細胞質(zhì)Toll-IL-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域。TLR分為細胞表面和內(nèi)體亞家族：細胞表面TLR（TLR1、TLR2、TLR4和TLR5）識別脂質(zhì)和蛋白質(zhì)成分，而內(nèi)體TLR（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和TLR13）專門用于核酸檢測；即脂多糖（TLR4）、脂肽（TLR2與TLR6或TLR1）、鞭毛蛋白（TLR5）、單鏈RNA（TLR7/8）、雙鏈RNA（TLR3）和含CpG基序的DNA（TLR9）。

TLRs激活的免疫反應(yīng)類型由特定TLR及其銜接蛋白激活的信號通路決定。一般來說，大多數(shù)TLR途徑導(dǎo)致Th1免疫反應(yīng)，但TLR2除外，可能由于TLR2配體的多樣性，TLR2可以誘導(dǎo)促炎和抗炎途徑，導(dǎo)致Th1、Th0或Th2免疫反應(yīng)。

除TLR3外，大多數(shù)TLR通過MyD88發(fā)揮作用。TLR激活后，MyD88募集由IL1受體相關(guān)激酶（IRAK）1、IRAK2和IRAK 4組成的寡聚復(fù)合物，并激活MyD88 TNF受體相關(guān)因子6（TRAF6）。活化的TRAF6隨后觸發(fā)核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，從而誘導(dǎo)促炎細胞因子，如IL-12和TNF-α。TLR7和TLR9可以激活TRAF3磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7），從而產(chǎn)生IFN-α。此外，TLR3和TLR4已被證明通過其TRIF銜接蛋白募集TRAF3來誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生，從而激活I(lǐng)RF3。I型IFN應(yīng)答可誘導(dǎo)強Th1細胞/細胞毒性T細胞（CTL）應(yīng)答，該應(yīng)答對鑒定和清除感染或癌細胞很重要。TLR2受體主要誘導(dǎo)以高IL-10產(chǎn)生和低IL-12為特征的強Th2免疫反應(yīng)。

TLR并不專門觸發(fā)Th1或Th2途徑，而是可以影響多種途徑。正是信號事件的平衡決定了免疫偏向。例如，一項研究表明，TLR4和TLR2激動劑的激活可以通過p38 MAPK和ERK1/2-FOS途徑刺激信號傳導(dǎo)，分別導(dǎo)致IL-12或IL-10的產(chǎn)生；然而，TLR4在比TLR2更高的閾值下誘導(dǎo)p38 MAPK信號傳導(dǎo)，而TLR2在比TLR4更高的閾下誘導(dǎo)ERK1/2信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致免疫極化。

TLRs在適應(yīng)性免疫中的作用

TLRs協(xié)調(diào)了從免疫細胞遷移到增強抗體親和力成熟的許多功能。TLRs作為危險信號傳感器，增加了免疫細胞向疫苗給藥部位的運輸。TLR參與可增強I類和II類MHC分子的抗原捕獲、處理和呈遞。某些特定類型的TLR可以不同程度地影響抗原的交叉呈遞，從而TLR3或TLR4，而不是TLR2或TLR7/8配體，減少CD8 +T細胞對抗原的攝取和交叉呈遞。TLR激活也可導(dǎo)致共刺激分子（如CD80和CD86）的上調(diào)，這對APC啟動幼稚T細胞至關(guān)重要。DC細胞的TLR在自我/非自我抗原識別以及是產(chǎn)生免疫反應(yīng)還是免疫耐受中起著關(guān)鍵作用。不同類型的APC表達不同的TLR，例如髓系DC表達TLR2和TLR4，而漿細胞樣DC（pDC）表達TRL7和TLR9。因此，TLR對不同DC譜系的優(yōu)先激活可以影響隨后的免疫偏向。

與小鼠相比，TLR在B細胞上的表達在人類中更為有限，人類主要表達TLR 2、7、9、10，TLR2配體需要通過B細胞受體（BCR）和TLR7的交聯(lián)進行額外增敏，TLR7需要1型干擾素（IFN）引發(fā)。這些TLR激動劑在體外誘導(dǎo)B細胞的增殖、活化和分化。最初，人們認為TLRs只促進B細胞的卵泡外反應(yīng)，其特征是快速產(chǎn)生低親和力抗體；然而，最近的研究表明，TLRs也可以增強生發(fā)中心反應(yīng)，從而產(chǎn)生高親和力抗體。TLR與BCR協(xié)同作用，誘導(dǎo)類轉(zhuǎn)換重組和抗體反應(yīng)的成熟。TLR4還增強了B細胞向引流淋巴結(jié)的遷移，并在此過程中加快了抗體類別的轉(zhuǎn)換。不適宜的B細胞TLR信號傳導(dǎo)與自身反應(yīng)性B細胞和自身免疫性疾病的產(chǎn)生有關(guān)；因此，在疫苗配方中避免過度的TLR刺激非常重要。

TLR也已被證明能增強各種不同的T細胞亞群。幾項研究表明，TLRs可以作為CD8+T細胞的共刺激分子，促進細胞增殖/存活、效應(yīng)器功能、細胞因子產(chǎn)生和記憶形成的增加。TLRs在Treg細胞中的作用仍然存在爭議。幾項研究表明，TLR2激動劑可誘導(dǎo)Treg抑制活性的暫時喪失；而其他研究表明，盡管TLR2激動劑可增加抗原特異性增殖，但Treg細胞仍保留其抑制功能。

TLR在疫苗佐劑中的應(yīng)用

天然存在和合成的TLR激動劑可以利用這些內(nèi)源性免疫信號通路來增強和調(diào)節(jié)疫苗反應(yīng)，從而使其成為優(yōu)良的疫苗佐劑。疫苗配方中使用的TLR激動劑有多種形式，從脂肽到單鏈DNA和RNA。下面介紹TLR佐劑的主要類別。

TLR2

TLR2在多種細胞表面表達，包括單核細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞、髓系抑制細胞、血小板和肥大細胞。TLR2識別的PAMP庫是最廣泛的，因為它能夠與TLR1和TLR6（以及人類中的TLR10）形成異二聚體。

TLR2佐劑的范圍很廣，包括合成脂肽（PAM3CSK4和PAM2CSK4）、阿拉伯甘露糖脂、脂磷壁酸、GPI膜錨定物、酵母多糖和肽聚糖。近年來TLR2研究的主要趨勢包括發(fā)現(xiàn)小型合成TLR2激動劑、改進傳統(tǒng)TLR2激動物的特性以及TLR2與疫苗抗原的生物偶聯(lián)。例如，XS15（PAM3CS-GDPKHPKSF）是一種新的基于PAM3CS的TLR-1/2激動劑，其中PAM3CSK4的四賴氨酸（K4）被九肽（GDPKHPKSF）取代，以改變偶聯(lián)物的水溶性，不僅促進攝取，而且易于純化。使用TLR2激動劑作為佐劑的局限性包括大多數(shù)配體的大小、復(fù)雜性和疏水性。

TLR3

TLR3是一種細胞內(nèi)識別系統(tǒng)，對病毒核酸（dsRNA、ssRNA和ssDNA）以及內(nèi)源性雙鏈RNA作出反應(yīng)。已經(jīng)開發(fā)了許多TLR3激動劑，如RGC100和ARNAX，一種合成的DNA-RNA雜交化合物。然而，在過去兩年中，研究人員又回到了使用傳統(tǒng)的dsRNA模擬配體，如poly IC，重點是改進其遞送模式和新的疾病應(yīng)用。

TLR4

TLR4是TLR家族中研究最多的成員，它識別脂多糖（LPS）。TLR4位于質(zhì)膜上，主要在髓系細胞上表達，而pDCs和幼稚B細胞不表達。TLR4通過其共受體骨髓分化因子-2（MD-2）和CD14識別LPS。最近關(guān)于TLR4激動劑的工作集中在修飾產(chǎn)物的開發(fā)和評估上，如單磷酸脂質(zhì)A（MPLA）和吡喃葡萄糖脂質(zhì)A（GLA），它們在結(jié)構(gòu)上與LPS相關(guān)，但沒有高致熱原性并保持強免疫增強特性，從而增加了其臨床應(yīng)用的可行性。

TLR5

TLR5識別鞭毛蛋白，并在上皮細胞和免疫細胞（如巨噬細胞和未成熟DC）上表達，通過MyD88依賴性信號通路產(chǎn)生免疫反應(yīng)。最近關(guān)于TLR5激動劑的工作主要集中在提高耐受性上。不幸的是，鞭毛蛋白會誘導(dǎo)不必要的過度反應(yīng)原性，作為一種蛋白質(zhì)，它可以誘導(dǎo)針對自身的抗體，干擾其作為佐劑的功能。有研究通過從鞭毛蛋白中去除B細胞表位區(qū)域解決了這一問題，脫免疫的鞭毛蛋白保留了其TLR5佐劑活性。

TLR7/8

TLR7和TLR8位于免疫細胞的內(nèi)涵體膜上。TLR7主要在pDC和B細胞中表達，而TLR8在髓系樹突狀細胞、單核細胞中表達，在pDC中表達程度較低。TLR7/8識別單鏈核糖核酸（ssRNA），并通過MyD88依賴性途徑發(fā)出信號。在天然配體中，富含腺苷和尿苷的寡核苷酸（ORN）能夠激活TLR8，而對TLR7沒有任何影響，而富含鳥苷的ORN激活TLR7和TLR8依賴性信號傳導(dǎo)。TLR7以單體形式存在，并在配體存在下二聚，而TLR8以天然存在的弱二聚體存在，在配體結(jié)合時發(fā)生構(gòu)象變化。目前已發(fā)現(xiàn)15種以上的新型雜環(huán)分子，如咪唑喹啉、蝶呤、嘧啶、吡啶嘧啶、吡咯嘧啶和苯并咪唑，被鑒定為TLR7/8激動劑。

TLR7/8激動劑的一個常見缺點是反應(yīng)原性，近年來，有大量研究試圖克服這些副作用。將TLR7/8激動劑封裝在基于陽離子DOEPC的脂質(zhì)體制劑納米顆粒中，或?qū)⑦@些小分子共價連接到超支化聚合物上，可以避免其有害的系統(tǒng)反應(yīng)，同時保持其對體液免疫的影響。

TLR9

TLR9在細胞內(nèi)定位于內(nèi)涵體膜中，識別細菌和病毒DNA的單鏈非甲基化CpG寡核苷酸。TLR9在免疫細胞上表達，如樹突狀細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞和其他APC。合成CpG序列可用作TLR9激動劑，以增強疫苗的免疫反應(yīng)，并且每種獨特的序列變異組合已被證明具有不同的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。

TLR9激動劑在過去兩年中的最新發(fā)展主要集中在CpG向細胞的有效遞送和攝取上。例如，一項研究介紹了一種將CpG-ODN偶聯(lián)到新型陽離子脂質(zhì)體上的新方法，該復(fù)合物能夠在低抗原和佐劑劑量下誘導(dǎo)強烈的免疫反應(yīng)。

組合TLR佐劑

將不同TLR的激動劑組合在單一疫苗中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，可以驅(qū)動強大的疫苗免疫反應(yīng)。例如，包含1V270（TLR7激動劑）和2B182C（TLR4激動劑）的脂質(zhì)體佐劑誘導(dǎo)了針對流感的平衡的抗HA和抗NA IgG1和IgG2a反應(yīng)，而沒有Th1促炎反應(yīng)常見的過度反應(yīng)原性。類似地，一項研究評估了卵清蛋白（OVA）與兩到三種TLR配體的十種獨特組合的共包封，包括Pam3CSK4（TLR2激動劑）、MPLA（TLR4激動劑），咪喹莫特（TLR7/8激動劑）和CpG（TLR9激動劑），而三重組合以總體平衡的Th1/Th2應(yīng)答促進抗原特異性抗體滴度。因此，TLR佐劑的組合可以提供廣泛的定制免疫反應(yīng)。

TLR激動劑與其他PAMP如NOD2和巨噬細胞誘導(dǎo)型Ca²的組合?-依賴性凝集素受體（Mincle）配體也很有前景。共價連接CL239（TLR7激動劑）和胞壁酰二肽（NOD2激動劑），并將雙激動劑作為納米顆粒與NP-p24 HIV疫苗結(jié)合，協(xié)同作用增強了對小鼠的保護。

小結(jié)

TLR的發(fā)現(xiàn)大大增強了我們對先天免疫反應(yīng)分子機制的理解，為創(chuàng)新的治療方法和疫苗開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。靶向TLR的合成激動劑已被證明是非常有利的佐劑，相反，TLR拮抗劑對于減輕過度免疫反應(yīng)具有重要價值，從而有助于治療以TLR異常激活為特征的自身免疫性疾病。

然而，關(guān)于單個TLR的特異性以及與其他PRR的潛在冗余問題仍然存在。微生物核酸被內(nèi)體TLR和細胞質(zhì)PRR識別，這確保了先天免疫系統(tǒng)能夠通過不同細胞隔室中的多個PRR對各種病原體做出有效反應(yīng)。TLR和PRR之間的相互作用是強有力地誘導(dǎo)免疫反應(yīng)所必需的，這些PRR的激動劑的組合通過激活DC協(xié)同增強佐劑療效。鑒于微生物病原體含有多種PAMP，這種協(xié)同作用可能在感染過程中自然發(fā)生，這可能解釋了為什么與疫苗接種相比，自然感染通常會誘導(dǎo)更強的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。然而，這種協(xié)同作用也可能與炎癥性疾病的加重有關(guān)。因此，了解TLR和其他PRR之間的協(xié)同作用和相互作用機制對于開發(fā)先進的疫苗佐劑以及控制TLR相關(guān)疾病的藥物至關(guān)重要。

參考文獻：

1.Toll-like receptor (TLR) agonists as a driving forcebehind next-generation vaccine adjuvants and cancer therapeutics. Curr OpinChem Biol.2022 Oct;70:102172

2. DecodingToll-like receptors: Recent insights and perspectives in innate immunity. Immunity.2024Apr 9;57(4):649-673.

       原文標題 : 揭秘Toll樣受體的前世今生