前言

嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法是一種過繼細胞療法，自體T細胞通過基因工程表達CAR以特異性殺死腫瘤細胞。自體CD19靶向CAR-T細胞目前已獲得大多數(shù)主要監(jiān)管機構(gòu)的批準，包括美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、歐洲藥品管理局（EMA）和中國NMPA。這些CAR-T細胞改變了臨床實踐，顯示出強大的抗腫瘤活性，

然而，在實體瘤患者中開發(fā)具有臨床實用性的CAR-T細胞仍然面臨重重困難，原因在很大程度上是未知的。有許多可能的原因，包括：（1）特異性不足的靶抗原；（2） 遞送不力；（3） 短持續(xù)性；（4） 效應(yīng)器功能喪失；和（5）腫瘤抗原異質(zhì)性。

因此，有必要從過往的CAR-T臨床前和臨床研究中汲取經(jīng)驗教訓，分析CAR-T細胞技術(shù)的要素和挑戰(zhàn)，并將基礎(chǔ)、臨床和實踐等方面的因素考慮在內(nèi)，采取應(yīng)對策略，從而使CAR-T技術(shù)能夠成為可負擔的治療模式。

了解CAR-T細胞在實體瘤中失敗的原因

遞送不力

CAR T細胞研究和開發(fā)中需要回答的兩個基本問題是，T細胞在靜脈注射后會去哪里，以及是它們進入腫瘤的有效性。

模型的臨床前數(shù)據(jù)表明，很少有注射的CAR-T細胞最初進入腫瘤，注射到同基因小鼠體內(nèi)的小鼠T細胞只持續(xù)幾周。人體的臨床試驗數(shù)據(jù)表明，CAR-T細胞最初在肺部和次級淋巴器官中積累，然后在接下來的24-48小時內(nèi)非常低效地轉(zhuǎn)移到腫瘤中。

CAR-T細胞進入腫瘤首先需要識別內(nèi)皮細胞表面分泌并結(jié)合的趨化因子，內(nèi)皮細胞主要位于腫瘤間質(zhì)中，而不是腫瘤細胞富集區(qū)。這種最初的內(nèi)皮識別之后是由選擇素介導(dǎo)的滾動粘附，然后是整合素的牢固粘附。在趨化因子（特別是CXCL9、CXCL10、CXCL11以及CCL5）的驅(qū)動下，T細胞然后遷移到腫瘤基質(zhì)中。在這里，血管周圍細胞、細胞外基質(zhì)蛋白和間充質(zhì)基質(zhì)細胞（主要是成纖維細胞）組成了屏障。一些T細胞通過間質(zhì)遷移，更少的T細胞最終在腫瘤衍生趨化因子的引導(dǎo)下進入腫瘤細胞富集區(qū)，在那里它們可以殺死腫瘤細胞，這一過程需要與腫瘤細胞上的ICAM1結(jié)合。這一過程效率極低，導(dǎo)致很少的T細胞成功地與腫瘤細胞相互作用。這里存在許多缺乏效率的原因，包括趨化因子-CCR失配、粘附受體缺陷和充當屏障的細胞外基質(zhì)。

另一個重要但被低估的問題可能是CAR-T細胞向淋巴組織和遠離實體瘤的“誤導(dǎo)”。到目前為止，CAR T細胞的制造主要受到在B細胞白血病或淋巴瘤患者中測試CD19靶向產(chǎn)品的試驗產(chǎn)生的數(shù)據(jù)指導(dǎo)，這些試驗強調(diào)了淋巴結(jié)和/或骨髓運輸、抗腫瘤活性的擴展和持久性的重要性。已知具有高水平CCR7和CD62L表達的T細胞優(yōu)先運輸?shù)搅馨徒Y(jié)或骨髓。因此，大多數(shù)當前方案的目標是產(chǎn)生主要具有中樞記憶細胞（CD62L高和CCR7高CD45RO+）表型的CAR-T細胞，而不是效應(yīng)記憶細胞（CD 62L低和CCR7-低CD45RO++）表型，這通常不利于向腫瘤的轉(zhuǎn)移。

此外，應(yīng)考慮另外兩個注意事項。首先，冷凍保存可能會影響CD62L的表達，從而影響運輸。其次，CD62L被認為通過其他機制促進抗腫瘤活性，具體而言，CD62L可能引導(dǎo)T細胞向某些實體瘤中存在的三級淋巴結(jié)構(gòu)內(nèi)的高內(nèi)皮細胞微靜脈運輸。這些淋巴結(jié)構(gòu)可能促進T細胞浸潤，并改善抗腫瘤免疫反應(yīng)。

短持久性

在涉及實體瘤患者的臨床試驗中，就CAR-T細胞的持久性而言，使用PCR或流式細胞術(shù)檢測，迄今為止進行的幾乎每一項試驗都顯示CAR-T細胞僅存在于血液樣本中。血液中CAR T細胞DNA轉(zhuǎn)錄物的范圍為每微克DNA103至104個拷貝，輸注后僅在約一個月內(nèi)檢測到CAR-T細胞，峰值通常出現(xiàn)在10-14天。相比之下，在白血病患者中測試CD19靶向CAR-T細胞的大多數(shù)成功試驗都發(fā)現(xiàn)，血液中有大量的CAR-T細胞，通常為每微克DNA 105-106個拷貝，其持續(xù)時間從幾個月到幾年不等。

總之，臨床前和臨床研究的結(jié)果表明，靜脈注射后，CAR-T細胞向腫瘤的轉(zhuǎn)運效率非常低，而且大多數(shù)這種轉(zhuǎn)運可能在注射后不久發(fā)生。從人類研究中獲得的有限數(shù)據(jù)表明，進入實體瘤的少數(shù)CAR-T細胞具有有限的持久性，并且不會廣泛增殖。

效應(yīng)器功能喪失

CAR-T細胞的臨床前研究一致發(fā)現(xiàn)，它們的細胞毒性活性最初很高，但隨著時間的推移逐漸降低�；�因組和表觀基因組的變化都與這種低功能狀態(tài)有關(guān)。誘發(fā)這種進行性功能減退狀態(tài)的原因尚不完全清楚�？赡芘cTME中存在的多種因素相關(guān)，包括低pH、缺氧、由于關(guān)鍵氨基酸和葡萄糖水平低而導(dǎo)致的營養(yǎng)缺乏、高水平的活性氧（ROS）、免疫抑制介質(zhì)（如TGF-β、PGE2、腺苷和IL-10）的存在，以及與骨髓來源的抑制細胞和CD4+調(diào)節(jié)性T細胞的相互作用。T細胞內(nèi)在因素包括由免疫檢查點（如PD-1、CTLA4、TIM3、TIGIT和LAG3）和抑制性細胞內(nèi)信號通路（如DGK、NR4A、SHP1和cbl-b）介導(dǎo)的“調(diào)節(jié)性關(guān)閉”。此外，還有多種表觀遺傳學變化。

腫瘤異質(zhì)性與抗原擴散

與B細胞惡性腫瘤或多發(fā)性骨髓瘤不同，實體瘤中的抗原表達幾乎總是較低且更異質(zhì)。因此，除非CAR-T細胞誘導(dǎo)某種旁觀者或抗原擴散效應(yīng)，或靶向多種抗原，否則成功治療的可能性很低。

我們可以汲取的經(jīng)驗教訓

某些實體瘤患者現(xiàn)在可以使用過繼性T細胞轉(zhuǎn)移成功治療，其中最顯著的成功是黑色素瘤患者的TIL治療。在非小細胞肺癌患者中使用TIL也取得了有希望的結(jié)果。我們可以從這些成功中學到什么，以使CAR-T細胞在實體瘤中取得更大的成功？

針對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移優(yōu)化的T細胞可能不是針對實體瘤的最佳細胞

與優(yōu)先運輸至外周位點的效應(yīng)細胞或效應(yīng)記憶細胞相比，CD62L和CCR7在幼稚或中央記憶T細胞上的高表達能夠優(yōu)先運輸至次級淋巴結(jié)和骨髓。當用于開發(fā)靶向?qū)嶓w瘤的CAR-T細胞時，這些表型的細胞可能是次優(yōu)的。實體瘤導(dǎo)向的CAR-T細胞被設(shè)計為靶向在實體瘤細胞表面表達的完整抗原。因此，當這些細胞進入骨髓或淋巴結(jié)時，它們將不會遇到它們的抗原，因此不會被激活以增殖或分化為效應(yīng)細胞，除非腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移到這些位置。數(shù)據(jù)顯示，在實體瘤模型中，效應(yīng)器CAR-T細胞比記憶T細胞更有效。因此，使用旨在優(yōu)化淋巴結(jié)運輸?shù)臉藴史桨府a(chǎn)生CAR-T細胞可能是實體瘤需要避免的一個關(guān)鍵教訓。

DC交互可能很重要

TIL或TCR-T細胞和CAR T細胞之間的一個重要區(qū)別是前者可以被DC廣泛激活，DC可以提供最佳的共刺激信號。這種共刺激可以發(fā)生在淋巴結(jié)和骨髓中。找到利用DC激活能力的方法，以增強CAR-T細胞增殖和持續(xù)的能力，是我們應(yīng)該嘗試從涉及TIL的試驗中吸取的經(jīng)驗。

可能不需要長期持久性

普遍認為，CAR-T細胞的成功與CAR-T細胞的持久性密切相關(guān)。然而，由于多種原因，在實體瘤患者中測試CAR-T細胞的臨床試驗中，持久性的重要性尚未得到證實。此外，來自實體瘤模型的數(shù)據(jù)表明，CAR-T細胞的持久性與T細胞功能低下水平的增加有關(guān)。

解決這一難題的方法如修飾CAR-T細胞，使其更持久，更不易發(fā)生功能低下。過去幾年，使用這種方法在實體瘤患者中取得了一些令人鼓舞的成功。然而，另一種需要考慮的方法是不考慮持久性，而是使用多次給藥策略給予新鮮的CAR-T細胞。隨著時間的推移，注射的CAR-T細胞會耗盡，它們可以被新劑量的高活性CAR-T細胞取代。這種方法減少CAR成分的免疫原性是必要的，以避免多次給藥的細胞被排斥。

靶向多種腫瘤抗原很重要

除了激活機制的差異外，TIL和CAR-T細胞之間的一個重要差異是，前者本質(zhì)上是多克隆的，因此可能靶向不止一種抗原。任何成功治療實體瘤患者的CAR-T細胞療法都需要靶向多個腫瘤特異性靶點，最佳地觸發(fā)某種旁觀者效應(yīng)或誘導(dǎo)抗原擴散到內(nèi)源性免疫系統(tǒng)。例如，通過設(shè)計分泌FLT3配體的CAR-T細胞對DC的募集，以及使用4-1BB激動劑的DC激活，以促進內(nèi)源性T細胞反應(yīng)和抗腫瘤活性增強。

如何更好地開發(fā)CAR-T

為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，可以考慮通過優(yōu)化兩種不同的策略來向前邁進，以在實體瘤患者中取得更大的成功。策略1是該領(lǐng)域的當前方向，基于為血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者開發(fā)的傳統(tǒng)“記憶細胞”模式。策略2采用不同的“短命效應(yīng)細胞”模式。

策略1：記憶細胞模式

這種方法的目標是最大限度地提高CAR-T細胞的運輸和持久性，同時最大限度地降低CAR T功能低下的程度。作為策略的一部分，大劑量化療的淋巴結(jié)清除用于增強植入。CAR-T細胞的持久性和低功能已經(jīng)通過向T細胞引入特定的遺傳改變（如通過CRISPR）來抑制可能的抑制因子來解決，允許T細胞“休息”，從而防止慢性刺激，或直接通過使用能夠分泌細胞因子或其他蛋白質(zhì)的武裝CAR-T細胞來改變TME。

與該策略相關(guān)的一個主要挑戰(zhàn)是需要引入多種基因改變。在過去的幾年里，許多研究已經(jīng)能夠使用標準的CRISPR技術(shù)敲除一個或多個基因，并且開發(fā)了許多更先進的CRISPR技術(shù)，能夠以非常低的脫靶突變率進行高效的基因編輯。

衍生自誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）的異基因T細胞的開發(fā)也可以提供一種替代方法，通過允許進行多種遺傳改變來改善CAR-T細胞的運輸和持久性。iPSC將首先使用各種CRISPR引導(dǎo)物進行修飾，從而能夠敲低選定的基因，使細胞具有低免疫原性，然后使用能夠敲低T細胞功能的選定關(guān)鍵抑制劑的引導(dǎo)物。在選擇具有所有預(yù)期改變的克隆后，可以添加額外的基因來增強運輸或功能。

策略2：短命效應(yīng)細胞模式

盡管沒有得到很好的研究，但一些數(shù)據(jù)支持在實體瘤小鼠模型中使用壽命更短、更像效應(yīng)器T細胞的優(yōu)越性。例如在對間皮素靶向CAR-T細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，具有CD28–CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（更像效應(yīng)器）的細胞比具有4-1BB–CD3z胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的細胞具有更好的抗腫瘤活性。

鑒于持久性不是目標，策略2也可能使用mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR T細胞。這種方法的一個明顯優(yōu)點是對轉(zhuǎn)基因的大小沒有限制，可以通過電穿孔引入一種以上的mRNA并同時表達，從而能夠引入多種遺傳變異。

然而，使用這種方法制備的mRNA–CAR-T細胞的一個潛在限制是，與策略1中的“一次性”方法相比，必須隨時間給藥多劑量CAR-T細胞的成本問題。盡管患者需要再次輸注，但這與化療或免疫檢查點抑制劑的給藥類似，通常每4-6周給藥一次，有時會持續(xù)多年。

小結(jié)

解決CAR-T細胞療法在實體瘤患者中的應(yīng)用所面臨的眾多挑戰(zhàn)是一項艱巨的任務(wù)。目前的治療方法對實體瘤患者基本無效，其中的原因我們并沒有完全理解。獲得更多更好的關(guān)于CAR-T細胞在接受治療的患者中的運輸、持久性和功能的信息對于解決這些方面的問題至關(guān)重要。

治療成功的大量障礙可能需要多種免疫逃避機制的共同靶向。這些策略將包括使用CAR工程的優(yōu)化，在離體T細胞擴增過程中優(yōu)化條件以促進特定T細胞亞型的出現(xiàn)，以及操縱宿主以改變TME或刺激天然T細胞，可能需要使用所有這些方法來實現(xiàn)最佳結(jié)果。

參考文獻：

1.CART cell therapy for patients with solid tumours: key lessons to learn andunlearn. Nat Rev Clin Oncol.2023 Oct 30

       原文標題 : 實體瘤的CAR-T細胞治療：關(guān)鍵的經(jīng)驗教訓