文章背景簡介

細胞呼吸、感染過程及化學、物理因子均可產生活性氧（ROS）。ROS會誘導DNA的堿基氧化及單鏈斷裂（SSBs），這種DNA損傷可被堿基切除／單鏈斷裂方式修復（BER／SSBR）。假如不修復，ROS誘導的損傷就會阻礙DNA復制和轉錄，導致基因組不穩(wěn)定，從而產生突變，進而驅動腫瘤發(fā)生。BER和SSBR均通過DNA聚合酶修復形成長片段或短片段，在DNA連接酶III或DNA連接酶Ⅰ的作用下進行連接。

在活細胞中，ROS誘導的DNA損傷可在時間和空間范圍內進行修復，而染色質結構對于DNA修復過程是至關重要的。利用含有旋轉定位尿嘧啶的重組核小體進行的體外研究表明在染色質損傷的情況下，BER酶的催化活性會受到抑制，ATP酶染色質重構因子SWI／SNF對8－oxoG BER的去除作用非常弱，說明染色質重構會促進BER。

2013年，匹茲堡大學的Li Lan等人在《Nucleic Acids Research》（IF＝11．561，生物1區(qū)）發(fā)表了題為“Novel method for site－specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin”的文章。本文使用特異性的熒光蛋白KillerRed （KR），在活細胞的特定基因位置產生ROS誘導的氧化損傷。利用這種基于活化KR生成ROS的潛在機制，研究開發(fā)了一個可視化實驗系統(tǒng)，通過將tetR－KR或TA－KR定位表達在人類細胞中特定的常染色質或異染色質位點上，從而可以實時觀察BER酶在特定位點的募集情況。

所用到的主要方法

1、熒光原位雜交；

2、染色質免疫共沉淀；

3、乙炔基尿苷滲入檢測RNA合成；

4、流式細胞術；

5、KR 激活；

6、細胞存活（MTT和菌落形成測定）

文章主要內容摘要

活性氧（ROS）誘導的DNA損傷可以通過堿基切除修復途徑進行修復。但染色質結構對損傷位點BER蛋白的募集影響尚不清楚。為了解決這個問題，本研究開發(fā)了一種新方法，將光刺激產生ROS的誘導因子KillerRed （KR）與tet－阻遏因子（tetR－KR）或轉錄激活因子（TA－KR）融合，特異性地產生ROS，誘導DNA損傷。在U2OS細胞中，TetR－KR或TA－KR分別與90kb的TRE結合，整合在特定的基因組位點，誘導異染色質或常染色質中ROS的損傷。研究發(fā)現(xiàn)在異染色質和常染色質中，DNA糖苷酶可有效地募集到DNA損傷位點，PARP1則更有效募集到濃縮染色質中，相反，F(xiàn)EN1募集到活性染色質的DNA損傷位點，并且以PCNA－和轉錄激活依賴的方式高度富集。這些結果表明，氧化性DNA損傷在異染色質或常染色質中的修復方式是不同的。