前言

基因治療是目前最火熱的治療領域之一,因為它針對的是疾病的潛在致病原因而不僅僅是癥狀。該療法可以誘導病變細胞中的基因表達或沉默,并已在臨床前試驗中取得成功,但其臨床應用依然受到基因載體免疫原性、致癌性、脫靶效應和療效的限制。

基因治療成功的關鍵考慮因素是用于傳遞治療性核酸以表達或沉默基因的載體。重組病毒已被用作基因治療載體,在細胞攝取、基因整合和長期基因表達方面更為有效,尤其是在體內,但是它們具有免疫原性、潛在的致癌作用和繁瑣的制造過程。為了解決這些局限性,人們開發(fā)了能夠避免免疫反應、具有廣泛的可調節(jié)性和質量控制的非病毒載體,但它們的轉染效率低,并導致轉基因的被動表達。

腺相關病毒(AAV)在基因治療方面的發(fā)展勢頭越來越大,越來越多的臨床試驗將其用于各種治療。截至目前,FDA批準的基于AAV的基因療法包括Sparktherapeutics的Luxturna和Avexis的藥物Zolgensma,分別用于治療遺傳性視網(wǎng)膜疾病和脊髓性肌萎縮癥。AAV因其較低的免疫原性和位點特異性整合能力被認為具有更好的安全性。然而,抗AAV的中和抗體在大多數(shù)人群中普遍存在,這限制了AAV的系統(tǒng)應用。人們目前的研究重點集中在工程化的AAV,通過對其衣殼進行分子修飾、與小分子和聚合物偶聯(lián)和絡合以及包裝在各種人工和天然載體(包括囊泡、水凝膠和聚合物)中,用于提高安全性、療效和多模式治療。使用AAV載體進行的臨床試驗的結果也強調了開發(fā)有效、安全和通用的載體在實現(xiàn)理想的基因治療方面的關鍵作用。

AAV的歷史與病毒學

AAV最早發(fā)現(xiàn)于20世紀60年代,被認為是腺病毒培養(yǎng)的污染物。然而,隨著發(fā)現(xiàn)AAV只有在腺病毒存在下才能復制,以及后來的單純皰疹病毒1型(HSV-1)的存在,腺病毒和AAV之間的聯(lián)系很快建立起來。在確定AAV可以轉化哺乳動物細胞后,研究人員開始生產重組AAV(rAAV)。含有腺病毒DNA的質�？梢元毩⒂谳o助病毒復制AAV。這一發(fā)現(xiàn)推動了該領域的發(fā)展,并真正開啟了AAV的基因治療領域。

AAV是一種小的、無包膜的細小病毒,在20-25nm的衣殼中基因組大小為?4．7kbp�；�因組分為復制(REP)和衣殼蛋白質(CAP)的兩個編碼區(qū),基因組兩端都有反向重復序列(ITR)。REP編碼與感染、整合和復制有關的四種蛋白質,Rep40、Rep52、Rep68和Rep78,而CAP編碼三種蛋白,VP1,VP2和VP3,它們分別以1:1:10的比例組成AAV的60-mer衣殼。VP3是最豐富的,構成了外殼結構的外部,而VP1和VP2構成內部。                          

AAV不能獨立復制,只有在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒)存在時,才能進行復制和溶細胞性感染,否則只能建立溶源性潛伏感染。AAV將其基因組整合到19號染色體上的一個特定位置,即AAVS1,或在染色體外獨立復制。AAV是非致病性的,即使在其自然狀態(tài)下也不會引起任何疾病;此外,它沒有系統(tǒng)的固有性免疫反應�？偣舶l(fā)現(xiàn)了12種天然的AAV衣殼血清型,并命名為AAV1-AAV12,它們顯示出優(yōu)先與體內特定組織結合的特性。

AAV不僅能感染活躍分裂的細胞,而且能感染靜止的細胞,這使得它對許多病毒和非病毒載體對基因傳遞不敏感的細胞群特別有價值,例如視網(wǎng)膜細胞和神經元細胞。AAV感染靜止細胞的自然能力促進了基因治療的許多顯著進步,例如FDA批準的治療Leber先天性黑朦的Luxturna(Spark Therapeutics)。

臨床上批準的基于AAV的基因治療藥物

在過去的20年中,基于AAV載體的基于治療在臨床轉化中的相關性不斷提高,目前占全球基因治療臨床試驗的8．1%。                      

第一個批準在歐洲臨床使用的基于AAV的基因治療藥物是alipogene tiparvovec(AT),用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥(LPLD),這是一種罕見的常染色體隱性疾病。該藥物于2012年獲得批準,商品名為Glybera。AT基因療法提供LPL基因的變體,LPLS447X,以糾正LPL患者LPL的功能。在III期臨床試驗中,給藥AT后14周,低脂飲食后乳糜微粒的峰值水平降低了79%。

目前有17種美國FDA批準的基因療法,包括AAV載體voretigene neparvovec rzyl(VN),由Spark Therapeutics于2017年開發(fā),商品名為Luxturna。VN包含一個包裹RPE6基因的AAV2,用于治療雙等位基因RPE65相關的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良癥,一種罕見的遺傳性疾病,導致視功能受損,隨年齡增長而下降,最終導致失明。在2012年進行的III期臨床試驗中(NCT00999609),Leber先天性黑朦2型患者接受視網(wǎng)膜下注射VN 1年后,65%的參與者獲得最大改善。在VN獲批之前,還沒有治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的藥物。

2019年獲得FDA批準的第二種基于AAV的基因療法是Onasemogene abeparvovec xioi(OA),由AveXis開發(fā),商品名為Zolgensma。OA利用表達功能性SMN1轉基因的AAV9治療2歲以下兒童的I型脊髓性肌萎縮癥(SMA1)。SMA1的特點是腦干和脊髓的運動神經元丟失,導致運動功能嚴重受損,并最終因呼吸衰竭死亡。它是導致嬰兒死亡的最常見單基因遺傳性疾病。在2017年一項名為STR1VE的三期臨床試驗中(NCT03306277),接受治療后, 91%的患者在14個月時仍無需永久性呼吸支持,50%的患者在18個月時能夠獨立靜坐。下表列出了正在進行和即將進行的基于AAV的臨床試驗。

應用AAV的治療干預策略

最常見的AAV介導的治療干預是基因置換,其特點是引入基因的功能拷貝來治療單基因疾病。這種方法主要用于罕見和不可治療的疾病,是上述兩種FDA批準的AAV基因治療的基礎�；�因置換的另一個顯著例子是正在進行的治療嚴重血友病A的臨床試驗,血友病A是凝血蛋白因子VIII缺乏癥。它是一種隱性的X連鎖疾病,在美國有三分之一的病例可由自發(fā)突變引起,在美國大約每5000個新生兒中就有1個發(fā)生這種疾病。在使用AAV治療血友病A的臨床試驗的中,有三家預計將于2020年底或2021年初開始第三階段臨床試驗(NCT04323098,NCT04370054,NCT03734588)。

基因添加是AAV基因治療最廣泛的應用,因為它可以用來治療更常見的非單基因的復雜疾病,如慢性、自身免疫性或感染性疾病。AAV用于基因添加的例子包括正在進行的治療類風濕關節(jié)炎的臨床試驗。目前,Arthrogen正在進行1期臨床試驗(NCT02727764),AAV載體攜帶IFN-β的轉基因,一種在骨和軟骨保護中起作用的抗炎介質。

與試圖克服功能缺失突變的基因置換不同,基因沉默,也稱為RNA干擾(RNAi),可以用來沉默有害的功能增益突變。在這種方法中,AAV轉基因對miRNA前體進行編碼,該前體由靶細胞自身的RNAi機制處理,以產生miRNA,一種小的非編碼RNA鏈,能夠與mRNA內的互補序列進行堿基配對以抑制其表達。使用AAV進行基因沉默的大多數(shù)努力仍在臨床前研究中,因為沉默有幾個特定的安全問題必須解決。一個主要問題是非靶點沉默的可能性。另一個問題是RNAi飽和的機制,在這種機制中,轉基因miRNA的表達可能壓倒并破壞內源性miRNA的產生,從而導致細胞毒性。目前,uniQure已經開始使用AAV基因療法治療亨廷頓病的臨床試驗(NCT049493)。

AAV應用的挑戰(zhàn)

大多數(shù)成功的用于臨床前和臨床研究的AAV僅限于天然的衣殼血清型,但這些AAV血清型在臨床上的廣泛應用存在明顯的局限性�？笰AV的中和抗體的存在仍然是全身輸送的一個重要障礙,這些中和抗體干擾AAV進入靶細胞、細胞內運輸和細胞核內的解包裝,從而阻止了轉導。為了更好地了解接觸AAV所產生的免疫反應,已經進行了一些研究,檢查了產生的IgG亞類,發(fā)現(xiàn)它們主要是IgG1。流行病學研究表明,在30-60%的人群中可發(fā)現(xiàn)血清陽性率不同的中和抗體。這些中和抗體中最流行的是針對AAV2的,其次是AAV1。

AAV介導的基因治療的另一個問題是基因組(4．7kbp)的大小限制,包括ITRs,給轉入的基因只留下一個?4．5kbp的大小空間,這將其靶向適應癥縮小到只能是那些小片段轉基因的表達。

工程化AAV

AAV可以通過衣殼修飾、表面偶聯(lián)和封裝進行設計,以解決天然AAV的局限性。

AAV工程化的一個共同目標是避免在全身給藥后血液循環(huán)中被中和抗體滅活。通過修飾中和抗體的衣殼結合位點來防止中和是一種很有前途的方法。然而,這些位點中的許多對AAV的轉導是必不可少的,因此在不損害其功能的前提下對其進行修飾具有挑戰(zhàn)性。此外,使用聚合物、脂類和水凝膠的表面栓系和包封都能夠保護AAV衣殼免受nAbs的侵襲,使其能夠逃避免疫系統(tǒng)的檢測和抗體反應。

AAV工程的另一個好處是通過將組織特異性配體結合到衣殼、表面偶聯(lián)和包封材料來改進靶向傳遞和活化。從封裝材料(如大孔徑的硅顆粒)中被動釋放aav可以延長循環(huán)時間和延長輸送時間。對外界和內部刺激(如光照、pH值變化或酶降解)有反應的材料允許AAV在靶組織或細胞類型中釋放或激活,而磁性粒子結合的AAV則通過施加磁場定向到靶上。

工程化AAV也可以用來克服有限的基因組大小,并結合多種治療方式進行多模式治療。疾病細胞中突變途徑中的多個基因可以通過傳遞兩個基因來重新編程,一個通過AAV,另一個通過表面偶聯(lián)或封裝的AAV載體中的第二個核酸;在組織工程支架中加入編碼AAV的生長因子可以通過基因激活和結構支持促進組織再生;聯(lián)合給藥和AAV同時干擾異�；顒雍椭鼐幊滩∽兗毎�,從而產生協(xié)同治療效果。

展望

隨著全球市場上臨床認可產品的出現(xiàn),以及越來越多正在進行的成功臨床試驗,AAV正處于基因治療的前沿,但其較小的基因組和中和抗體限制了其在許多疾病中的應用。工程化的AAV可以解決這些問題,同時提供了額外的好處,包括可控和刺激響應釋放,擴展的組織定向,以及多模式聯(lián)運。多模式工程化AAV解決了AAV和單一模式基因治療的局限性,因為它們不僅擴展了治療潛力,而且可以協(xié)同作用于疾病本身的多個方面。目前正在探索的將第二種治療方式結合起來的工程化AAV是基因治療的一個尚未開發(fā)的領域,可以超越傳統(tǒng)的單一模式基因傳遞系統(tǒng)。雖然進一步的技術進步還需要推進更多的臨床試驗來驗證,但多模式工程化AAV已經在未來的基因治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

參考文獻:

1．Synthetically Engineered Adeno-Associated Virus for Efficient,Safe, and Versatile Gene Therapy Applications． ACS Nano． 2020 Oct 19．

2． clinicaltrials．gov